简 介
ADAR酶在RNA中针对位于特定双链环状结构中的腺苷执行A-to-I编辑。ADAR1有两种亚型——p150和p110，它们通过使用单独的启动子和交替剪接产生的。
Fig 1. ADAR editor靶向的双链mRNA环示例
ADAR1功能丧失突变导致dsRNA传感器的异常激活。ADAR1在多种肿瘤中高表达，并且ADAR1基因敲除可以改善对特定免疫治疗（如PD-1/PD-L1阻断）的反应，并绕过肿瘤免疫治疗抵抗机制，这使ADAR1成为治疗开发的具有前景的靶点。
原 理
细胞系含有可作为ADAR1编辑靶标的发卡结构，该结构位于Firefly荧光素酶基因的上游，且包含终止密码子（UAG），并可在ADAR1介导的编辑下转变为色氨酸（UUG）密码子。
结 果
ADAR1过表达的HEK293细胞显示出高荧光素酶活性，此活性在siRNA介导的ADAR1表达敲低后减少。
Fig 2. 三种ADAR1报告基因细胞系的原理
ADAR1报告基因结构包含一个含有终止密码子（UAG）的ADAR1靶点，该密码子位于编码Firefly荧光素酶的序列的上游。在没有ADAR1的情况下，荧光素酶不会转录，细胞无荧光素酶活性。在存在ADAR1活性的情况下，腺嘌呤被转化为肌苷，所得的密码子对应氨基酸色氨酸（UUG），从而使荧光素酶的转录和表达成为可能。因此，ADAR1活性与荧光素酶活性直接相关。
选择HEK293细胞是因为它们的内源性ADAR1表达相对较低。
ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）需要转导并稳定整合报告基因结构。该细胞需要经过转染才能表达ADAR1，并诱导荧光素酶的表达。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）是通过将ADAR1转导到#82238，然后进行抗生素筛选和克隆而生成的。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）是从#82239改造而成，可稳定表达Renilla荧光素酶。Renilla荧光素酶活性作为细胞活力的指标，让用户在评估化合物对ADAR1活性影响的同时评估其毒性。
Fig 3. ADAR Reporter #2具有最佳的ADAR1响应和选择性。
使用三种报告基因设计，生成了HEK293 cell pool，并使用转染ADAR1质粒的瞬转来筛选敏感性高，响应强的细胞系。
鉴于ADAR1和ADAR2的RNA靶标序列存在重叠，ADAR2过表达可能产生的影响。图3A显示，三种ADAR报告基因中的两种在ADAR1过表达时触发了荧光素酶活性。其中，ADAR Reporter #2在ADAR2表达时没有响应，与ADAR Reporter #1相比，ADAR Reporter #2对ADAR1具有更好的特异性（图3B）。因此，选择ADAR Reporter #2制备稳转细胞系。
Fig 4. 稳转ADAR1响应型报告细胞系对ADAR1有响应，对ADAR2无响应。
从表达Reporter #2的HEK293 cell pool中选择稳定的、单克隆细胞系。通过瞬转ADAR2或ADAR1的p150或p110亚型，比较荧光素酶活性。
结果表明，与p110相比，对ADAR1 p150活性的偏好响应，ADAR2过表达时检测到的荧光素酶活性很小。
在21代的稳定性测试中，该细胞系一直维持的荧光素酶活性。
为了，通过将ADAR1 p150亚型通过 慢病毒转导到ADAR1响应型报告HEK293细胞系中，生成ADAR1过表达HEK293细胞系，可评估ADAR1为靶点的化合物。
ADAR1的siRNA knockdown使荧光素酶活性减少，说明荧光素酶活性来自ADAR1过表达（图5B）。ADAR1 knockdown并不诱导细胞毒性（图5C）。因此，细胞死亡并未导致观察到的荧光素酶活性降低。
将96孔板和384孔板进行比较显示，与对照组相比，细胞系具有强且稳定的信号（图6）。
Fig 5. ADAR1活性荧光素报告HEK293细胞系中的荧光素酶活性源于ADAR1的表达。
Fig 6. ADAR1过表达的报告基因细胞中ADAR1依赖的荧光素酶活性一致性高。
该细胞系可同时评估ADAR1活性和化合物诱导的细胞毒性。ADAR1活性报告荧光素HEK293细胞系可稳定、持续表达Renilla荧光素酶。Firefly和Renilla荧光素酶活性都与细胞密度相关（图7）。
图7. 在ADAR1活性双荧光素酶报告基因细胞系中，Firefly荧光素酶和Renilla荧光素酶信号与细胞数量呈正相关。
三种细胞系可支持ADAR1研究的不同方面：
ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）可比较ADAR1修饰和突变对ADAR1活性的影响，例如研究结构/功能关系，或者研究RNA编辑的ADAR1变体。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）稳定表达ADAR1，适用于评估ADAR1调节剂（如小分子抑制剂）的疗效。可进行高通量筛选。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）可在评估靶向ADAR1化合物（如小分子抑制剂）的效力的同时，进行毒性测定。
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更新时间：2024-07-11 
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