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ADAR1 编辑活性报告基因细胞系的开发

更新时间:2024-07-11      浏览次数:19

 简 介

ADAR酶在RNA中针对位于特定双链环状结构中的腺苷执行A-to-I编辑。ADAR1有两种亚型——p150和p110,它们通过使用单独的启动子和交替剪接产生的。

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Fig 1. ADAR editor靶向的双链mRNA环示例


ADAR1功能丧失突变导致dsRNA传感器的异常激活。ADAR1在多种肿瘤中高表达,并且ADAR1基因敲除可以改善对特定免疫治疗(如PD-1/PD-L1阻断)的反应,并绕过肿瘤免疫治疗抵抗机制,这使ADAR1成为治疗开发的具有前景的靶点。


原 理

细胞系含有可作为ADAR1编辑靶标的发卡结构,该结构位于Firefly荧光素酶基因的上游,且包含终止密码子(UAG),并可在ADAR1介导的编辑下转变为色氨酸(UUG)密码子。


结 果

ADAR1过表达的HEK293细胞显示出高荧光素酶活性,此活性在siRNA介导的ADAR1表达敲低后减少。



02
细胞系和检测原理



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图片图片Fig 2. 三种ADAR1报告基因细胞系的原理


ADAR1报告基因结构包含一个含有终止密码子(UAG)的ADAR1靶点,该密码子位于编码Firefly荧光素酶的序列的上游。在没有ADAR1的情况下,荧光素酶不会转录,细胞无荧光素酶活性。在存在ADAR1活性的情况下,腺嘌呤被转化为肌苷,所得的密码子对应氨基酸色氨酸(UUG),从而使荧光素酶的转录和表达成为可能。因此,ADAR1活性与荧光素酶活性直接相关。


选择HEK293细胞是因为它们的内源性ADAR1表达相对较低。



  • ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line( #82238)需要转导并稳定整合报告基因结构。该细胞需要经过转染才能表达ADAR1,并诱导荧光素酶的表达。


  • ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line( #82239)是通过将ADAR1转导到#82238,然后进行抗生素筛选和克隆而生成的。


  • ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line( #82240)是从#82239改造而成,可稳定表达Renilla荧光素酶。Renilla荧光素酶活性作为细胞活力的指标,让用户在评估化合物对ADAR1活性影响的同时评估其毒性。

03
报告基因优化

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Fig 3. ADAR Reporter #2具有最佳的ADAR1响应和选择性。


使用三种报告基因设计,生成了HEK293 cell pool,并使用转染ADAR1质粒的瞬转来筛选敏感性高,响应强的细胞系。


鉴于ADAR1和ADAR2的RNA靶标序列存在重叠,ADAR2过表达可能产生的影响。图3A显示,三种ADAR报告基因中的两种在ADAR1过表达时触发了荧光素酶活性。其中,ADAR Reporter #2在ADAR2表达时没有响应,与ADAR Reporter #1相比,ADAR Reporter #2对ADAR1具有更好的特异性(图3B)。因此,选择ADAR Reporter #2制备稳转细胞系。


04
ADAR1响应型报告基因细胞系

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Fig 4. 稳转ADAR1响应型报告细胞系对ADAR1有响应,对ADAR2无响应。


从表达Reporter #2的HEK293 cell pool中选择稳定的、单克隆细胞系。通过瞬转ADAR2或ADAR1的p150或p110亚型,比较荧光素酶活性。


结果表明,与p110相比,对ADAR1 p150活性的偏好响应,ADAR2过表达时检测到的荧光素酶活性很小。


在21代的稳定性测试中,该细胞系一直维持的荧光素酶活性。



05
ADAR1活性荧光素酶报告细胞系


为了,通过将ADAR1 p150亚型通过 慢病毒转导到ADAR1响应型报告HEK293细胞系中,生成ADAR1过表达HEK293细胞系,可评估ADAR1为靶点的化合物


ADAR1的siRNA knockdown使荧光素酶活性减少,说明荧光素酶活性来自ADAR1过表达(图5B)。ADAR1 knockdown并不诱导细胞毒性(图5C)。因此,细胞死亡并未导致观察到的荧光素酶活性降低。


将96孔板和384孔板进行比较显示,与对照组相比,细胞系具有强且稳定的信号(图6)。

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Fig 5. ADAR1活性荧光素报告HEK293细胞系中的荧光素酶活性源于ADAR1的表达。


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Fig 6. ADAR1过表达的报告基因细胞中ADAR1依赖的荧光素酶活性一致性高。



06
ADAR1活性双荧光素酶报告细胞系

该细胞系可同时评估ADAR1活性和化合物诱导的细胞毒性。ADAR1活性报告荧光素HEK293细胞系可稳定、持续表达Renilla荧光素酶。Firefly和Renilla荧光素酶活性都与细胞密度相关(图7)。


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图7. 在ADAR1活性双荧光素酶报告基因细胞系中,Firefly荧光素酶和Renilla荧光素酶信号与细胞数量呈正相关。

07
结论

三种细胞系可支持ADAR1研究的不同方面:

  • ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line( #82238)可比较ADAR1修饰和突变对ADAR1活性的影响,例如研究结构/功能关系,或者研究RNA编辑的ADAR1变体。

  • ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line( #82239)稳定表达ADAR1,适用于评估ADAR1调节剂(如小分子抑制剂)的疗效。可进行高通量筛选。

  • ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line( #82240)可在评估靶向ADAR1化合物(如小分子抑制剂)的效力的同时,进行毒性测定。


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